События игры происходят между четвёртой и пятой частями. Главными героями игры становятся Крис Редфилд и Джилл Валентайн.

Город Террагригия  был основан на искусственном острове в Средиземном море в течение одиннадцати лет. В своё время этот «плавающий город» был одним из главных туристических мест, предназначенных для «Королевы Зенобии» Круиз Лайнс, круизной линии, работающей вокруг Италии. Террагригия также был первым городом, способным содержать своё население только с помощью солнечной энергии, что дало ему звание самого экологически чистого города из всех существующих. В 2004 году био-террористическая организация «Il Veltro», выступавшая против данной разработки, начала атаку на город, используя «Б.О.О.» (Био органическое оружие). В ответ Федеральная био-террористическая комиссия (ФБК), чтобы держать ситуацию под контролем, послала своих агентов, включая Джессику и Паркера. После уничтожения террористов, город был объявлен биологически опасным. Всех его жителей эвакуировали, а город был изолирован в радиусе ста миль. Данный инцидент теперь помнят как «Паника Террагригии», который является самым мрачным примером атаки с использованием био-оружия с чёрного рынка.

В 2005 году «Il Veltro» объявляется вновь, угрожая заразить одну пятую часть океанов Земли вирусом «Т-Abyss», морским вирусом, полученным из смертоносного Т-вируса. В качестве демонстрации, террористы угнали лайнер «Королева Зенобия» и устроили вспышку вируса на борту судна. Руководство BSAA отправило Криса Редфилда и Джессику Шероэт, чтобы понять действия террористов, однако связь с агентами прервалась. Тогда на их поиск отправляют ещё двух агентов — Джилл Валентайн и Паркера Лукиэни. Агентам дают координаты последнего контакта с пропавшими — лайнер «Королева Зенобия».

Игра возвращается к «истокам» серии и представляет собой смесь жанров Action-adventure и Survival Horror. В плане игрового процесса игра сочетает в себе элементы первой и четвертой частей. В основном, игроку дана большая локация, по которой он может условно свободно перемещаться. Большинство дверей заперто, поэтому для доступа к новым участкам карты игроку требуется искать ключи, карточки доступа, а также решать головоломки и сражаться с монстрами.

Однако главной чертой игры является именно возврат к классической манере игры. Как и раньше, мы имеем одну локацию и несколько временно недоступных зон. Для доступа к ним нужно искать ключи, карточки доступа, взламывать электрощиты, решать головоломки. Монстры не просто бродят по локации: они могут вылезать из вентиляционных труб, из темноты, нападать неожиданно и часто группами по три и более особей. Как и раньше, их можно замедлить, стреляя в конкретные части тела, но самое уязвимое их место - голова. Из существ больше не «выпадают» патроны и прочие бонусы. Патроны, аптечки и дополнительные бонусы нужно искать либо самому, либо используя сканер «Genesis», который также подходит для сканирования останков врагов и получения дополнительных аптечек. Боезапас игрока ограничен, а его расширение достигается поиском сумок для патронов. Также появились небольшие чемоданчики для апгрейда оружия, на манер деталей для оружия из Resident Evil 2. Сама игра стала более мрачной и коридорной. Основная часть локаций игры выполнена в стиле особняка из оригинальной игры.

Боевая система игры копирует Resident Evil 4. Как и раньше, камера находится за спиной или закреплена за плечом героя во время прицеливания. Здесь же добавлена возможность перемещаться во время прицеливания, что существенно упрощает игру. Также добавлена возможность уклоняться от вражеских атак. Враги в игре более выносливы: их нельзя «оглушить» выстрелом в глаз или колено, но можно слегка замедлить. В процессе игры игрок «меняет» персонажа, что также отражается на игровом процессе, поскольку у каждого персонажа свои предпочтения к конкретному оружию. В игру ввели новое устройство - сканер «Genesis». Устройство помогает игроку искать многие скрытые патроны и бонусы, которые сперва не видны, а после обнаружения сканером подсвечиваются и становятся доступными. Также сканер используется для сканирования биоматериала, чтобы разработать вакцину (аптечку).